|
|
Produkce rekombinantního IL-2 imunocytokinu nového typu
Bednaříková, Kristýna ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Interleukin 2 je glykoprotein, který se u člověka skládá ze 133 aminokyselin a je produkován pomocnými T buňkami pro zesílení imunitních reakcí. IL-2 má mnoho imunostimulačních a imunoregulačních funkcí a bylo prokázáno, že aktivuje cytotoxickou funkci přirozených zabíječských buněk, T lymfocytů a monocytů a podporuje cytotoxicitu těchto efektorových buněk. Pokud je v rámci terapie IL-2 podán ve vyšších dávkách, stimuluje efektorové lymfocyty a brání organismus před patogeny a nádorovými buňkami. Pokud je IL-2 podán v nižších dávkách, tak dochází k stimulaci T regulačních buněk, které inhibují imunitní reakci a tím dochází k udržení autotolerance. Zatímco dosavadní studie ukázaly, že IL-2 je účinný při léčbě malignit, byla také pozorována značná toxicita. V posledních letech byly publikovány studie na základě kterých bylo zjištěno, že pokud je IL-2 kovalentně vázán skrz oligopeptidovou spojku na anti-IL-2 monoklonální protilátky, dojde ke zvýšení jeho biologické aktivity in vivo. Zároveň může tato protilátka stericky bránit vazbě na některé podjednotky IL-2 receptoru a přispět tak k selektivní aktivaci a expanzi přirozeně zabíječských buněk a T efektorových buněk, zatímco T regulační stimulovány nejsou. Při spojení IL-2 s anti-IL-2 protilátkou hraje klíčovou roli délka peptidové spojky, jejíž prodloužení by...
|
|
|
Rekombinantní exprese potkaního NK buněčného receptoru Clr-b v přítomnosti fluorovaných analogů monosacharidů
Urbanová, Zuzana ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
NK buňky jsou buňkami nespecifické imunity, které kromě likvidace tělu vlastních poškozených buněk také produkují chemokiny a cytokiny, kterými zasahují i do imunity specifické, stojí tedy na pomezí obou těchto druhů imunity. NK buňky na svém povrchu exprimují aktivační a inhibiční receptory, jejichž rovnováha udržuje buňku v inaktivovaném stavu, narušení této rovnováhy spustí cytotoxické mechanismy buňky. Dvěma z potkaních inhibičních receptorů NK buněk jsou receptory NKR-P1B a NKR-P1D, jejichž ligandem je protein Clr-b, což je receptor z rodiny proteinů podobných lektinům typu C. Cílem práce bylo rekombinantně připravit tento protein v prostředí sedmi fluorovaných analogů monosacharidů jakožto potenciálních inhibitorů N-glykosylace proteinu. Protein byl úspěšně exprimován v buněčné linii HEK293T ve formě konstruktu obsahujícího kromě extracelulární části Clr-b také Fc fragment lidského IgG a histidinovou kotvu, a to několikrát, pokaždé v prostředí jednoho ze sedmi fluorovaných analogů monosacharidů. Vzhledem k tomu, že glykosylace proteinů má výrazný vliv na jejich funkčnost, se inhibice glykosylace se jeví jako vhodné terapeutické řešení mnoha nemocí včetně například roztroušené sklerózy či rakoviny. Cílem zde bylo posoudit vliv fluorovaných analogů monosacharidů na přirozenou N-glykosylaci...
|
|
|
Produkce a charakterizace mutované formy galektinu-3
Dubanych, Yurii ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Ječmen, Tomáš (oponent)
Přirozeně zabijácké buňky (NK buňky, z angl. natural killer) jsou velké granulární lymfocyty vrozené imunity, které jsou charakterizovány schopností zabíjet rakovinné a virem poškozené buňky bez předchozí aktivace. Cytotoxické funkce NK buněk jsou regulovány jednak prostřednictvím povrchových receptorů rozpoznávajících molekuly MHC-I, jednak přítomností sady aktivačních a inhibičních receptorů, které jsou mezi sebou za normálních podmínek v rovnováze. Osud cílové buňky proto záleží nejen na expresi MHC-I, ale i na expresi ligandů aktivujících receptory NK buněk. Jedním z aktivačních receptorů NK buněk je NKp30. Pro NKp30 byly objeveny tři specifické buněčné ligandy: lidský athanogen 6 asociovaný s BCL-2 (BAG-6, také známý jako BAT3), nádorový antigen B7-H6 a nově objevený ligand galektin-3. Všechny tyto ligandy jsou často exprimovány rakovinnými buňkami, přičemž BAG-6 a Gal-3 působí na funkce NK buněk inhibičně, což může být mechanismem úniku nádoru před imunitním systémem. Proto je Gal-3 novým potenciálním cílem léků, které inhibicí Gal-3 mohou napomáhat imunitnímu systému bránit se proti maligně transformovaným buňkám. Tato bakalářská práce zahrnuje ověření vlivu mutace Cys173 - Ser173 v sacharid vazebné doméně galektinu-3 na vazbu receptoru NKp30 pomocí gelové permeační chromatografie. Dále se...
|
|
|
Role of TCTP1 in plant reproduction
Pitoňak, Oliver ; Hafidh, Said (vedoucí práce) ; Lafon Placette, Clément (oponent)
TCTP je evolučně konzervovaný eukaryotní protein zapojený do regulace řady buněčných procesů, například translace, buněčného cyklu a buněčné smrti. U člověka je TCTP z buňky sekretován a účastní se imunitní odpovědi. Pro jeho extracelulární funkci je zásadní schopnost dimerizace přes terminální cysteinový zbytek. Porovnání sekvencí TCTP u různých eukaryotních organismů odhalilo, že tento zbytek je evolučně konzervován nejen u živočichů, ale i u rostlin. Na rozdíl od živočišných modelů jsou poznatky o TCTP v rostlinách omezené. V genomu huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana) jsou kódovány dva paralogní geny TCTP1 a TCTP2. TCTP1 je silně exprimován v pylu. Publikované studie ukazují na jeho úlohu ve vývoji embrya a růstu pylové láčky. V této diplomové práci byla dále studována úloha TCTP1 v pohlavním rozmnožování rostlin s využitím metod fenotypové charakterizace mutantní linie a analýzy subcelulární lokalizace. V heterologním bakteriálním systému byl exprimován rekombinantní TCTP1 z huseníčku rolního a jeho potenciální interakční partneři BRL2 a TTL3. Charakterizace mutantní linie tctp-1 naznačila roli TCTP1 v růstu pylové láčky. TCTP1 exprimován pod kontrolou nativního promotoru lokalizoval v cytoplazmě pylu a pylové láčky. Rekombinantní AtTCTP1 v in vitro podmínkách vytvářel dimery. Mutace...
|
|
|
Produkce IL2-fúzních protilátek a stanovení jejich biologické aktivity
Frantová, Eliška ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Interleukin 2 je malý cytokin s mnoha důležitými imunitními funkcemi. Uplatňuje se zejména jako růstový faktor T buněk, ale působí také na další imunitní buňky a to především na NK a NK-T buňky. IL-2 ve vyšších dávkách indukuje diferenciaci a proliferaci buněčné populace efektorových a paměťových T buněk, které se vyznačují cytotoxicitou a jsou schopny účinné obrany organismu před patogeny anebo nádorovými buňkami. Naproti tomu IL-2 v nízkých dávkách stimuluje populaci Treg, které tlumí imunitní reakce a pomáhají předcházet autoimunitním onemocněním. V nádorové terapii je však stimulace této buněčné populace nežádoucí. Protože je volný IL-2 ve vysokých dávkách pro organismus toxický, byly již dříve navrženy strategie, pomocí kterých by se biologický efekt IL-2 potencoval. Jako jedna z nejslibnějších se jeví jednořetězcový rekombinantní fúzní konstrukt, kde je IL-2 kovalentně vázán pomocí oligopeptidové spojky na anti-IL-2 monoklonální protilátku (mAb). Na základě poznatků ze studia IL-2/anti-IL-2 mAb imunokomplexů by v porovnání s volným IL-2 tento imunocytokin (IC) mohl poskytnout značné terapeutické benefity in vivo, a to především velmi robustní posílení biologické aktivity, selektivní stimulaci konkrétních buněčných populací dle zvolené protilátky a snížení systémové toxicity. Důležitou roli u...
|
|
|
Studium proteas virů Zika a Dengue
Novotný, Pavel ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Vondrášek, Jiří (oponent)
Zika a Dengue jsou flaviviry šířící se v lidských populacích obývající tropické oblasti skrze komáří mezihostitele. Flaviviry způsobují horečky, které se mohou v případě Dengue rozvinout až do život ohrožující hemorrhagické formy. Existuje možná souvislost mezi těhotnými ženami nakaženými virem Zika a zvýšeným rizikem vzniku mikrocefalie u novorozenců. Flavivirové horečky se v dnešní době léčí hlavně symptomaticky, nicméně je zde snaha o vývoj látek blokující životní cyklus virů a jejich šíření v organismu. Vhodným cílem takových látek jsou specifické virové enzymy, například flavivirová proteasa. Tato serinová proteasa chymotrypsinového typu je tvořena heterodimerem flavivirových nestrukturních proteinů NS2B a NS3. Doména NS3 obsahuje také helikasu, tu je však možné pro studii samotné proteasy rekombinantně odstranit. Protein NS2B je transmembránový, s doménou NS3 však interaguje pouze hydrofilní, 40 aminokyselinový peptid. Ten funguje jako chaperon a podílí se na vazbě substrátu v aktivním místě. V této práci bylo studováno šest variant rekombinantních proteinů obsahující aktivační peptid NS2B a proteasovou doménu NS3. Tyto proteiny byly exprimovány a purifikovány. Čtyři varianty byly charakterizovány v enzymologických studiích, včetně testování možných inhibitorů. Toto testování odhalilo...
|
|
|
Expression and characterisation of homologs of human glutamate carboxypeptidase II
Bäumlová, Adriana ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Český abstrakt Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII, EC 3.4.17.21) je membránové vázaný glykoprotein který patří do rodiny metalopeptidas M28. Pro tento enzym byly nalezeny dva fysiologické substráty. Prvním z nich je N-acetyl-aspartyl glutamát (NAAG), který slouží jako neurotransmiter v lidském mozku a GCPII při jeho štěpení produkuje volný glutamát do synapse. Nadbytečný glutamát může být cytotoxický a v důsledku vést k excitotoxické smrti nervových buněk. Bylo prokázáno, že inhibice této aktivity má neuroprotektivní účinek. Proto byla inhibice GCPII navržena jako možný terapeutický cíl při léčení neurologických chorob, ve kterých dochází k vytváření nadbytečného glutamátu. Druhým substrátem je polygamaglutamylfolát, je prekursorem kyseliny listové, která je nezbytná pro růst a vývoj buněk. GCPII odštěpuje glutamát z folátů v potravinách a tím usnadňuje jejich absorpci v tenkém střevu. Ačkoli je biologická role GCPII známa jen v mozku a tenkém střevu, prostata je další tkání, ve které GCPII hraje důležitou roli. GCPII byla popsána jako marker nádorů prostaty, protože se vyskytuje na membránách nádorových buněk. Jedná o transmembránový protein II. typu, navíc enzymově aktivní, který prochází internalizací: všechny tyto vlastnosti z něj vytvářejí velmi slibný nástroj pro specifickou protinádorovou terapii....
|
|
|
Rekombinantní exprese a funkční charakterizace rostlinných Kunitzových inhibitorů
Rybáriková, Renata ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
PDI (z angl. "potato cathepsin D inhibitor") a NID (z angl. "novel inhibitor of cathepsin D") z lilku brambor (Solanum tuberosum) patří do proteinové rodiny Kunitzových inhibitorů (rodina I3 podle databáze Merops). Tyto isoinhibitory s molekulovou hmotností cca 20 kDa a typickou prostorovou architekturou β-trojlístku inhibují aspartátové a serinové peptidasy. Byly připraveny konstrukty pro rekombinantní expresi PDI a NID v kvasinkovém expresním systému Pichia pastoris a vybrány kolonie pro jejich účinnou produkci. Oba proteiny byly identifikovány v kultivačním médiu pomocí hmotnostní spektrometrie a N-koncového sekvenování. Pro PDI byl navržen isolační protokol se třemi chromatografickými kroky. Purifikovaný rekombinantní PDI byl porovnán s nativním PDI z přírodního zdroje a byly prokázány analogické funkční vlastnosti. Analýza inhibiční specifity dále ukázala, že PDI inhibuje vybrané aspartátové peptidasy rodiny A1 a serinové peptidasy rodiny S1 včetně relevantního enzymu hmyzího původu. To podporuje hypotézu o funkci Kunitzových inhibitorů jako obranných molekul rostlin proti herbivornímu hmyzu. Připravené inhibitory budou využity pro analýzu reaktivních center proti cílovým peptidasám pomocí proteinové krystalografie. Klíčová slova: proteolytické enzymy, aktivita a inhibice enzymů, aspartátové a serinové...
|
|
|
Studium vlivu N-vázané glykosylace na funkci nanoprotilátky cílící receptor HER2
Chytrá, Gabriela ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Nádorová onemocnění jsou v současnosti velmi rozšířená a jejich kompletní léčba vyžaduje eliminaci všech nádorových buněk v organismu. Jedním ze způsobu léčby je imunoterapie, která se snaží vyvolat imunitní odpověď a aktivovat tak protinádorové obranné mechanismy organismu. K tomu se používají terapeutické protilátky, které cílí markery na nádorových buňkách. Jeden z těchto markerů je receptor HER2, jehož exprese je zvýšená například na povrchu nádorových buněk karcinomu prsu. Jako terapeutické protilátky se často používají humanizované monoklonální protilátky, ale používají se i jiné konstrukty, jako jsou bispecifické částice, nanoprotilátky či jejich analogy. Nanoprotilátkami se označují rekombinantní variabilní domény odvozené od protilátek, které ve své struktuře postrádají lehké řetězce. V přírodě se takové protilátky přirozeně vyskytují například u savců z čeledi velbloudovití nebo u některých paryb, jako jsou žraloci. Tato práce popisuje přípravu různých glykoforem nanoprotilátky antiHER2 a ověření vlivu této glykosylace na vazbu nanoprotilátky na povrch buněčné linie exprimující na svém povrchu receptor HER2. Byla připravena nanoprotilátka s komplexní přirozenou glykosylací (produkovaná v buněčné linii HEK293T) a nanoprotilátka s homogenní glykosylací (produkovaná v buněčné linii HEK293S...
|
|
|
Studium proteas virů Zika a Dengue
Novotný, Pavel ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Vondrášek, Jiří (oponent)
Zika a Dengue jsou flaviviry šířící se v lidských populacích obývající tropické oblasti skrze komáří mezihostitele. Flaviviry způsobují horečky, které se mohou v případě Dengue rozvinout až do život ohrožující hemorrhagické formy. Existuje možná souvislost mezi těhotnými ženami nakaženými virem Zika a zvýšeným rizikem vzniku mikrocefalie u novorozenců. Flavivirové horečky se v dnešní době léčí hlavně symptomaticky, nicméně je zde snaha o vývoj látek blokující životní cyklus virů a jejich šíření v organismu. Vhodným cílem takových látek jsou specifické virové enzymy, například flavivirová proteasa. Tato serinová proteasa chymotrypsinového typu je tvořena heterodimerem flavivirových nestrukturních proteinů NS2B a NS3. Doména NS3 obsahuje také helikasu, tu je však možné pro studii samotné proteasy rekombinantně odstranit. Protein NS2B je transmembránový, s doménou NS3 však interaguje pouze hydrofilní, 40 aminokyselinový peptid. Ten funguje jako chaperon a podílí se na vazbě substrátu v aktivním místě. V této práci bylo studováno šest variant rekombinantních proteinů obsahující aktivační peptid NS2B a proteasovou doménu NS3. Tyto proteiny byly exprimovány a purifikovány. Čtyři varianty byly charakterizovány v enzymologických studiích, včetně testování možných inhibitorů. Toto testování odhalilo...
|
host ::
RSS.